王老师
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目的
了解密度梯度离心法分离淋巴细胞的原理及其操作过程.
原理
淋巴细胞分离掖是由60%的聚蔗糖2份和34%的泛影葡胺1份混合制成.它具有分子量大、无化学活性、20℃时比重为1.077士0.001的特性.血液中各种细胞的比重不同,淋巴细胞与单核细胞的比重约为1.070,而粒细胞和红细胞的比重为1.092左右.将血液加至分离液上,通过离心,可使一定比重的细胞按相应密度梯度进行分布,从而将淋巴细胞与其它血细胞分离开.
材料
1.淋巴细胞分离液 (比重1.077土0.001).
2.肝素.
3.无Ca2+、Mg2+的Hanks溶液,pH7.7.6.
4.RPMI-1640培养液(含10%小牛血清).
5.其它:注射器、吸管、滴管（均为无菌）,血球计数板,水平离心机,显微镜等.
方法
1.无菌抽取静脉血2ml,去掉针头注人含有肝素的无菌试管中摇匀,加入2ml Hanks溶液进行对倍稀释,混匀.
2.用吸管吸取稀释血液沿试管壁缓缓加到含有2ml淋巴细胞分离液的试管中（血液:Hanks液:淋巴细胞分离液的比例为1:1:1）,沿管壁流下的稀释血液叠加在分离液之上,并与分离液形成明显的界面.
3.经水平式离心2000r/min×20min,小心取出试管.
4.用平口吸管小心吸取中层呈白色雾状的淋巴细胞层,用Hanks溶液洗涤两次,每次离心1500r/min×10min.
5.弃上清,加RPMI-1640培养液1ml混匀,取少许进行细胞计数及活力测定.
（1） 细胞计数:取1滴细胞悬液置血球计数板上,静置片刻,显微镜下计数四角四个大方格内的细胞数（见图15）,按下列公式计算出细胞总数.
四个大方格细胞总数 ×稀释倍数×细胞悬液毫升数×104
细胞总数 = 4
（2）台盼蓝拒染法测定细胞活力:取4份0.2%台盼蓝与1份4.25%生理盐水混合,将台盼蓝生理盐水溶液与细胞悬液等量混合,在3分钟之内压片,在光学显微镜下计数未染色的细胞（为活细胞）与染色细胞（染成兰色,为死细胞）,计算活细胞占细胞总数的百分数.
活细胞数 ×100%.
细胞存活率＝ 活细胞数+死细胞数
6.最后将淋巴细胞悬液用RPMI-1640培养液配成相应的细胞浓度备用.
结果
在回收细胞分离液上界面的总细胞中单个核细胞应占90%以上（同时细胞存活率应大于90%）,其中的粒细胞占0-5%,血小板小于0.5%,红细胞占0-7%.
注意事项
1.抽血后在2小时内使用.
2.注意将稀释后的血轻轻地沿管壁铺在聚蔗糖液面上,避免破坏其界面.
3.在收集单个核细胞时,将吸管轻轻插入单个核细胞层,沿管壁轻轻旋转吸取细胞.
整个试验给你 有详细步骤的
希望我的回答对你有所帮助
