王老师
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在模板变性后温度快速冷却至40℃～60℃(某个退火温度)的时候,可使引物和模板发生结合.由于模板DNA 比引物复杂得多,引物和模板之间的碰撞结合机会远远高于模板互补链之间的碰撞,这就使PCR后期的过程成为可能.退火温度与时间,取决于引物的长度、碱基组成及其浓度,还有靶基序列的长度.对于20个核苷酸,G+C含量约50%的引物,55℃为选择最适退火温度的起点较为理想.
另一种说法：熔解温度（Tm）是引物的一个重要参数.这是当50％的引物和互补序列表现为双链DNA分子时的温度.Tm对于设定PCR退火温度是必需的.在理想状态下,退火温度足够低,以保证引物同目的序列有效退火,同时还要足够高,以减少非特异性结合.合理的退火温度从55℃到70℃.退火温度一般设定比引物的 Tm低5℃.
设定Tm有几种公式.有的是来源于高盐溶液中的杂交,适用于小于18碱基的引物.有的是根据GC含量估算Tm.确定引物Tm最可信的方法是近邻分析法.这种方法从序列一级结构和相邻碱基的特性预测引物的杂交稳定性.大部分计算机程序使用近邻分析法.
Tm值除了用软件之外,还可以这个公式：2（A+T）+4（C+G）,然后减5—10度
根据所使用的公式及引物序列的不同,Tm会差异很大.因为大部分公式提供一个估算的Tm值,所有退火温度只是一个起始点.可以通过分析几个逐步提高退火温度的反应以提高特异性.开始低于估算的Tm5℃,以2℃为增量,逐步提高退火温度.较高的退火温度会减少引物二聚体和非特异性产物的形成.
为获得最佳结果,两个引物应具有近似的Tm值.引物对的Tm差异如果超过5℃,就会引物在循环中使用较低的退火温度而表现出明显的错误起始.如果两个引物Tm不同,将退火温度设定为比最低的Tm低5℃
或者为了提高特异性,可以在根据较高Tm设计的退火温度先进行5个循环,然后在根据较低Tm设计的退火温度进行剩余的循环.这使得在较为严紧的条件下可以获得目的模板的部分拷贝.
另外,由于PCR仪的不同,注意其退火温度的设定：一般的PCR仪允许设置跨度12-15度的梯度范围,所以你的梯度范围尽可能设置宽一点,争取一轮梯度就可以确定最佳可用退火温度.
具体从多少度到多少度,要看你这对引物的Tm值,如果两个引物Tm值不高,可以设置48-60的梯度；否则可以设置58-70度的梯度；如果两个引物的Tm中等,则可以设置53-65的梯度范围,具体情况灵活掌握.
传统梯度PCR仪中是可以放置12个样品进行梯度的,需要注意的是每个相邻两孔间的温度差异是不等的,尤其是第2、3孔与第1孔接近,第10、11孔与第12孔接近.可以舍弃第2、2、10、11孔,只在第1、4、5、6、7、8、9、12孔中放置共8个样品,孔间温度变化几乎呈真正的梯度状.
